Thermofisher XN70冷冻切片仪，多种组织切片经验。

1.概述

    冰冻切片（Frozen Section）与免疫荧光（Immunofluorescence, IF）是生物学和医学研究中常用的技术组合，用于快速制备组织样本并进行特定蛋白或抗原的定位检测。该技术具有操作简便、保存抗原性良好、实验周期短等优势，广泛应用于病理诊断、神经科学、细胞生物学等领域。

2.实验原理

 2.1 冰冻切片

原理：利用低温（-20℃至-80℃）使组织快速冷冻固化，然后通过冷冻切片机（Cryostat）切成薄片（通常4-20μm）。

- 优点：

  - 避免石蜡包埋过程中的抗原破坏。

  - 适用于对热敏感的组织或需要快速检测的样本（如术中病理诊断）。

- 缺点：

  - 组织结构保存不如石蜡切片完整。

  - 长期储存可能导致冰晶形成，影响切片质量。

 2.2 免疫荧光

- 原理：利用荧光标记的抗体（一抗或二抗）与目标抗原结合，通过荧光显微镜观察定位。

- 分类：

  - 直接免疫荧光：一抗直接偶联荧光染料。

  - 间接免疫荧光：一抗未标记，通过荧光标记的二抗检测。

- 优点：

  - 高特异性、高灵敏度。

  - 可进行多色标记（不同荧光染料对应不同抗原）。

3. 实验步骤

 3.1 样本准备

1. 组织取材：

   - 新鲜组织迅速取材，避免自溶。

   - 用PBS或生理盐水冲洗血液。

2. 冷冻包埋：

   - 将组织置于OCT（Optimal Cutting Temperature）包埋剂中。

   - 用液氮或干冰快速冷冻（-80℃保存备用）。

 3.2 冰冻切片

1. 切片机预冷：冷冻切片机温度设定为-20℃至-25℃。

2. 切片：

   - 将冷冻组织块固定在样品台上，切成4-10μm薄片。

   - 贴附于载玻片（防脱载玻片更佳）。

3. 固定：

   - 4%多聚甲醛（PFA）固定10-15分钟（或丙酮固定5分钟）。

   - PBS洗涤3次，每次5分钟。

 3.3 免疫荧光染色

1. 封闭：

   - 使用5% BSA或10%血清（同二抗来源）封闭30分钟（室温）。

2. 一抗孵育：

   - 滴加稀释的一抗（参考说明书优化浓度），4℃过夜或室温1-2小时。

   - PBS洗涤3次，每次5分钟。

3. 二抗孵育：

   - 滴加荧光标记的二抗（如FITC、Cy3、Alexa Fluor系列），避光孵育1小时（室温）。

   - PBS洗涤3次，每次5分钟。

4. 核染色（可选）：

   - DAPI（1μg/mL）染核5分钟，PBS洗涤。

5. 封片：

   - 用抗荧光淬灭封片剂（如甘油/PBS或商用封片剂）封片。

 3.4 荧光显微镜观察

- 使用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察，选择合适的激发/发射滤光片。

- 避免长时间光照以防荧光淬灭。

 4. 注意事项

1. 样本新鲜度：长时间存放可能导致抗原降解，建议尽快切片。

2. 切片厚度：过厚会增加非特异性信号，过薄可能导致组织撕裂。

3. 抗体优化：

   - 需进行抗体浓度和孵育时间优化。

   - 设置阴性对照（不加一抗）排除非特异性结合。

4. 避光操作：荧光染料易淬灭，全程避光。

5. 防止脱片：

   - 使用防脱载玻片。

   - 避免过度洗涤。

5. 应用领域

- 病理诊断：快速检测肿瘤标志物（如HER2、EGFR）。

- 神经科学：观察神经元或胶质细胞标记物（如GFAP、NeuN）。

- 免疫学研究：检测炎症因子或免疫细胞浸润（如CD4+ T细胞）。

- 发育生物学：研究胚胎组织特定蛋白表达。