又称免疫印迹（immunoblotting）具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。

一、基本原理

1. 核心目的：通过抗体与目标蛋白的特异性结合，对样本中的特定蛋白进行定性和半定量分析。

2. 关键步骤：

   - 电泳分离：利用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）按分子量大小分离蛋白质。

   - 转膜：将分离的蛋白质从凝胶转移到固相膜（如PVDF或硝酸纤维素膜）上，便于后续抗体处理。

   - 免疫检测：通过一抗识别目标蛋白，二抗（偶联酶或荧光染料）放大信号，最终显色或发光检测。

二、实验流程

1. 样本制备：

   - 裂解细胞或组织，提取总蛋白。

   - 使用BCA或Bradford法测定蛋白浓度，确保上样量一致。

2. SDS-PAGE电泳：

   - 蛋白样品与SDS结合（带负电），在凝胶中依分子量迁移。

   - 小分子量蛋白迁移更快，靠近凝胶底部。

3. 转膜（Blotting）：

   - 湿转或半干转法将蛋白从凝胶转移到膜上。

   - 转膜效率可通过预染Marker或丽春红染色验证。

4. 封闭（Blocking）：

   - 用脱脂牛奶或BSA封闭膜上的非特异性结合位点，减少背景信号。

5. 抗体孵育：

   - 一抗孵育：与目标蛋白特异性结合（通常4°C过夜）。

   - 二抗孵育：偶联HRP（辣根过氧化物酶）或AP（碱性磷酸酶）的二抗与一抗结合（室温1-2小时）。

6. 信号检测：

   - 化学发光法（常用）：HRP催化底物（如ECL）发光，X光片或成像系统捕获信号。

   - 显色法：底物（如DAB）产生可见沉淀，但灵敏度较低。

三、关键应用

1. 蛋白表达分析：比较不同样本（如疾病vs正常组织）中目标蛋白的表达差异。

2. 翻译后修饰研究：检测磷酸化、泛素化等修饰（需使用修饰特异性抗体）。

3. 抗体验证：确认抗体的特异性或检测重组蛋白表达。

4. 分子量测定：通过与Marker对比，估算目标蛋白大小。

四、注意事项与常见问题

1. 优化条件：

   - 抗体浓度、封闭剂选择、洗涤时间需优化以减少非特异性信号。

   - 转膜时间/电流影响大分子量蛋白的转移效率。

2. 内参（Loading Control）：

   - 使用β-actin、GAPDH等管家蛋白确保上样量一致。

3. 常见问题：

   - 高背景：封闭不充分或抗体浓度过高。

   - 无信号：抗体失效或转膜失败。

   - 非特异条带：抗体交叉反应或样本降解。

Western blotting因其可靠性和广泛适用性，至今仍是蛋白质研究的基础技术，尤其在疾病机制、药物靶点验证等领域不可或缺。