1.概述

荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）是一种高灵敏度、高特异性的核酸定量技术，广泛应用于mRNA表达水平的检测。该技术通过在PCR反应体系中加入荧光标记物，实时监测扩增产物的积累，从而实现对起始模板的定量分析。

2. 技术原理

2.1 基本流程

2.2 荧光检测机制

目前常用的荧光检测方法主要有两种：

2.2.1 非特异性荧光染料法（如SYBR Green I）

- 原理：SYBR Green I是一种能与双链DNA小沟结合的荧光染料

- 特点：

  - 结合后荧光信号显著增强

  - 成本低，使用简便

  - 需配合熔解曲线分析确认扩增特异性

 2.2.2 特异性荧光探针法（如TaqMan探针）

- 原理：

  - 探针5'端标记报告荧光基团，3'端标记淬灭基团

  - Taq DNA聚合酶的5'→3'外切酶活性水解探针，释放荧光

- 特点：

  - 特异性更高

  - 可进行多重PCR

  - 成本较高

 2.3 定量原理

荧光定量PCR通过监测荧光信号达到设定阈值时的循环数（Ct值）进行定量：

- Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数

- 标准曲线法：使用已知浓度的标准品建立Ct值与起始模板量的对数关系

- 相对定量法（2-ΔΔCt法）：

  - 比较处理组与对照组的靶基因表达差异

  - 需使用内参基因进行校正

 3. 实验关键环节

3.1 RNA提取与质量评估

- 提取方法：Trizol法、柱膜法等

- 质量评估指标：

  - A260/A280比值：1.8-2.0

  - A260/A230比值：>2.0

  - RNA完整性：电泳或RIN值评估

 3.2 逆转录反应

- 逆转录酶选择：M-MLV、AMV等

- 引物设计：

  - Oligo(dT)：适用于polyA+ mRNA

  - 随机引物：适用于所有RNA，包括非polyA RNA

  - 基因特异性引物：特异性最高

 3.3 引物与探针设计

- 基本原则：

  - 长度：18-22bp

  - Tm值：58-60℃

  - GC含量：40-60%

  - 避免二级结构和引物二聚体

- 验证要求：

  - 扩增效率：90-110%

  - 特异性：单一峰熔解曲线或单一扩增条带

 4. 数据分析方法

4.1 绝对定量

- 使用标准品建立标准曲线

- 计算未知样品中的绝对拷贝数

4.2 相对定量

常用2-ΔΔCt法：

1. 计算ΔCt = Ct(靶基因) - Ct(内参基因)

2. 计算ΔΔCt = ΔCt(实验组) - ΔCt(对照组)

3. 相对表达量 = 2-ΔΔCt

 4.3 数据标准化

- 内参基因选择：GAPDH、β-actin、18S rRNA等

- 多内参基因策略可提高可靠性

 5. 技术优势

1. 高灵敏度：可检测单拷贝基因

2. 宽动态范围：可达7-8个数量级

3. 高特异性：特别是探针法

4. 高通量：可同时检测多个样本/基因

5. 无PCR后处理：闭管操作减少污染

 6. 主要应用领域

6.1 基础研究

- 基因表达谱分析

- 信号通路研究

- 转录调控机制研究

- 差异表达基因验证

6.2 医学应用

- 疾病诊断：

  - 肿瘤标志物检测

  - 病原体核酸检测

  - 遗传病诊断

- 预后评估：

  - 肿瘤分子分型

  - 治疗靶点表达分析

- 药物研发：

  - 药物靶点验证

  - 药效评价

  - 毒性评估

 6.3 农业应用

- 转基因作物检测

- 病原体检测

- 性状相关基因表达分析

 6.4 环境监测

- 环境微生物检测

- 生物标志物分析

 7. 技术发展

7.1 数字PCR（dPCR）

- 绝对定量，不依赖标准曲线

- 更高灵敏度和准确性

- 适合低丰度样本和稀有突变检测

 7.2 多重qPCR

- 同时检测多个靶标

- 节省样本和试剂

- 需优化引物探针组合

 7.3 高通量qPCR

- 384孔板或更高通量

- 自动化操作

- 大规模表达谱分析

 8. 展望

荧光定量PCR技术作为基因表达分析的金标准，未来发展趋势包括：

- 更高通量的微流控系统

- 更便捷的现场检测设备

- 与测序技术的联合应用

- 人工智能辅助的数据分析

随着技术的不断革新，荧光定量PCR将在生命科学研究和临床诊断中发挥更加重要的作用。