微小RNA（microRNA, miRNA）是一类长度约18-25个核苷酸的非编码RNA分子，在基因表达调控、细胞分化、发育及疾病（如癌症、心血管疾病、神经退行性疾病等）中发挥重要作用。由于miRNA表达量通常较低且序列较短，其检测方法需要高灵敏度和特异性。实时荧光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）是目前最常用的miRNA检测技术之一，具有高灵敏度、高特异性和可定量等优势。

miRNA qPCR检测的原理

由于miRNA长度短（18-25 nt），直接扩增困难，通常采用以下策略：

1. 加尾法（Polyadenylation + RT）： 

   - 使用poly(A)聚合酶在miRNA 3'端添加poly(A)尾。 

   - 采用带oligo(dT)和特异锚定序列的通用逆转录引物进行cDNA合成。 

   - qPCR时使用通用反向引物和miRNA特异性正向引物进行扩增（如QIAGEN公司 miScript系统）。 

2. 茎环引物法（Stem-loop RT primer）： 

   - 设计茎环结构的逆转录引物，提高结合特异性。 

   - 逆转录后，采用miRNA特异性引物和通用引物进行qPCR（如Thermofisher TaqMan miRNA assay系统）。

荧光检测方式

1. SYBR Green法： 

  - 结合双链DNA发出荧光，成本低，但可能产生非特异扩增。 

  - 需进行熔解曲线分析验证特异性。 

2. TaqMan探针法： 

  - 采用miRNA特异探针（5'端荧光报告基团，3'端淬灭基团），特异性更高。 

miRNA qPCR实验流程

1.样本准备-总RNA抽提（组织，细胞，各种体液都可以）

2.逆转录（RT）

3.qPCR扩增

4.数据分析

- 常用内参基因： 

  - U6 snRNA 

  - snoRNA（如RNU44、RNU48） 

  - 5S rRNA 

miRNA qPCR的应用

1 基础研究

miRNA表达谱分析：比较不同组织、发育阶段或处理条件下的miRNA表达差异。 

功能研究：过表达/敲低miRNA后检测靶基因变化。 

2 临床诊断

癌症生物标志物：如miR-21（多种癌症高表达）、miR-155（淋巴瘤）。 

心血管疾病：miR-208a（心肌梗死标志物）。 

3 药物开发

miRNA靶向药物：如miR-122抑制剂（抗丙肝病毒）。 

药物响应预测：miR-34a与化疗敏感性相关。